Molecular Cloning and Partial Characterization of Tetrahymena Thermophila Mitogen Activated Proteın Kinase 1 (TtMPK1) Gene

Abstract

In eukaryotes, environment and mitogens determine cell’s basic phenotypes mainly through mitogen activated protein kinase (MAPK) pathways. In this study, a cDNA fragment coding a putative MAPK gene from Tetrahymena thermophila was cloned by RT-PCR using degenerate oligonucleotide primers. This cDNA was designated TtMPK1 based upon the presence of 11 subdomains and TEY dual phosphorylation motif in protein kinase subdomain VIII. TtMPK1 cDNA fragment has a 1230 bp long single open reading frame (ORF) encoding a polypeptide of 409 amino acids with a predicted size of 47.5 kDa. Southern blot analysis indicated that TtMPK1 is a single copy gene in tetrahymena genome. Western blot analyses with anti-carboxyl TtMPK1 serum showed that MPK1 antibody recognize not only 48 kDa expected size protein but also unexpected 65 kDa protein. By using an-ti-phospho antibodies in western blot, these two proteins showed to be phosphorylated in threonine and tyrosine. Immunoprecipitates of anti-carboxyl polypeptide of MPK1 antibody tested in in vitro kinase assay had a low level of kinase activity. This is the first demonstration of a serine/threonine kinase enzyme in the unicellular eukaryotic protozoan T. thermophila.

Ökaryotik organizmalarda, çevresel etkiler ve mitojenler, mitojenlerce aktifleştirilen protein kinaz (MAPK) sinyal yoluyla hücrenin ana morfolojisini ve biyolojisini belirler. Bu çalışmada, tek hücreli organizma Tetrahymena thermophila"dan olası bir MAPK genini kodlayan cDNA RT-PZR yöntemiyle yarıbozuk primer seti kullanılarak klonlandı. Bu cDNA’nın kodladığı genin tahmini proteininin, MAPK enzim ailesinin karakteristik 1 alt domaini ile TEY fosforilasyon motifini VIII altdomainde bulundurmasından dolayı TtMPK1 ismi verilmiştir. TtMPK1 cDNA’sı 1230 bç’lik 409 amino asit kodlayan bir protein okuma çerçevesi içerir ve proteinin hesaplanmış büyüklüğü 47.5 kDa’dur. TtMPK1 geninin Southern blot analizi, genin Tetrahymena genomunda tek kopya olarak bulunduğunu göstermiştir. TtMPK1’in karboksil ucu son 14 amino asitine karşı oluşturulan poliklonal antiserum, western blotda 48 kDa’lık beklenen büyüklük ile 65 kDa’luk beklenilmeyen büyüklükte iki protein algılamıştır. Western blot’ın anti-fosfo antikorlarla tekrarlanması ise bu iki proteininde fosforile edildiğini göstermiştir. Anti-karboksil MPK1 polipeptid serumunun 38°C’de büyütülmüş hücrelerden çökerttiği proteinler, in vitro kinaz testinde bazal aktivitenin bir katına yakın bir aktivite göstermişlerdir. Bu çalışma ile bu organizmada ilk defa bir serin-treonin kinaz enziminin varlığı gösterilmiştir.