SiRNA taşıyıcı sistem geliştirme ve değerlendirme çalışmaları

Abstract

Kontrolsüz hücre çoğalması, kitle veya tümör oluşumu ile karakterize olan kanser günümüzün en önemli sağlık sorunlarından birisidir. Kontrolsüz gerçekleşen çoğalma, DNA’da meydana gelen mutasyonlar sonucu (onkojen aktivasyonu, tümör süpresör gen inaktivasyonu, vb) hücre apoptozunun gerçekleşememesi ile ortaya çıkmaktadır. Memeli hücrelerinde 2001’de Tuschl ve ark. tarafından ilk kez keşfedilen siRNA, bugüne kadar kanser tedavisinde, anjiyojenezin inhibe edilmesinde, çeşitli onkojenlerin inhibisyonu ve hücre-içi sinyal iletim sistem genlerinin inhibisyonuile tümör gelişiminin durdurulması ve apoptozun indüklenmesinde, radyo veya kemo hassaslığının arttırılması çalışmalarında kullanılmaktadır. Bu tez çalışmasında da farklı lipidik ve polimerik sistemlerin siRNA teknolojisi için kullanılması hedeflenmiştir. Lipidik yapıdaki sistemler için ‘Katı Lipit Nanopartiküller’ (KLN), polimerik yapı için ise yeni geliştirilmiş ve yine çokfazla çalışılmamışsuda çözünebilenkitosan polimerleri kullanılmıştır. Genetikmateryal olarak Bcl-2 siRNA’sı seçilmiştir.KLNhazırlanmasında çeşitli yöntemler kullanılmış(sonikasyon ve yüksek hızdakarıştırma ile basit emülsiyon)ve zeta potansiyel,parçacıkbüyüklüğü, siRNAbağlayabilmeözelllikleri açısındandeğerlendirilmiştir. Bu özellikler açısındanenuygun olduğuna karar verilensonikasyon ile ve yüksek hızda karıştırma ilehazırlananbirer formülasyon tranfeksiyon çalışmaları için kullanılmıştır.. Kitosançalışmasında isepolimerik formülasyon hazırlamak içinfarklı moleküler ağırlığasahipkitosanlar kullanılmıştır. Bu formülasyonlarda dakarakterizasyonçalışmaları yapıldıktan sonrasiRNA bağlama ve sitotoksisite açısındandeğerlendirildiğinde en fazla 10 kDamoleküler ağırlıklı kitosanın(K4)transfeksiyon için uygun olduğu saptanmıştır.A549 ve MCF-7 hücrelerindeyapılan transfeksiyon çalışmaları sonucundasonikasyon ile hazırlanan formülasyon kontrol olarak kullanılan Lipofektamin®2000’e yakın transfeksiyon etkinliği gösterirken, Kitosanformülasyonu (K4) çok fazla etkinlik gösterememiştir. Transfeksiyon etkinliğinin analizi için yapılan Western Blot çalışmasında 72. saatte Lipofektamin’in Bcl-2proteini basklılayabildiği tespit edilirken sonikasyon ile hazırlanan formülasyonun kitosan ile hazırlanan formülasyona göre daha çok baskılama özelliği gösterdiği saptanmıştır.