H-ras aktif hücrelerinin fibronektin proteinine bağlanma yeteneklerinin incelenmesi

Abstract

Ras proteini, aktif olduğu hücrelerde sinyal iletimi yollarının düzenlenmesinde, hücre büyümesi ve farklılasmasında merkezi bir moleküldür. Embriyogenezde, yara iyilestirmede ve mitozun artmıs olduğu durumlarda ras proteininin hücre içi ekspresyonu artmaktadır. Ras uyarıcı döngünün aktiflesmesinin, çesitli kanserlerin ilerlemesinde önemli bir etken olduğu bulunmustur. Fibronektin, ekstraselüler matriksin glikoprotein ailesine ait yüksek moleküler kütleli bir proteinidir. % 5 karbonhidrat içerir ve hücre zarındaki spesifik integrin moleküllerine bağlanır. Fibronektin, hücre gelisimi, hücre farklılasması, doku olusumu, apoptoz gibi birçok hücresel olayda önemli etkiye sahiptir. Fibronektin reseptörleri tümörojenik fenotiple iliskilendirilmistir ve metastaz için önemlidir. Bu çalısmada, H-ras aktif sıçan embriyo fibroblast hücreleri (5RP7)’nin çoğalma oranının zamana bağlı olarak belirlenmesi, bu hücrelerin fibronektin proteinine bağlanma kapasitelerinin ve bu bağlanmanın hücre apoptozu üzerine etkilerini belirlenmesi amaçlanmıstır. 5RP7 hücrelerinin büyüme eğrisinin belirlenmesi için tripan mavisi ile boyama yöntemi, bu hücrelerin fibronektine bağlanma kapasitesinin belirlenmesi için MTT yöntemi kullanılmıs, değisik konsantrasyonlardaki fibronektin’e bağlı hücrelerin apoptozunda kaspaz enzim aktivitesinin belirlenmesi için DNA parçalanma oranları ölçülmüstür. 5RP7 hücre konsantrasyonları zamana bağlı olarak doğru orantılı bir artıs göstermistir ve etki çalısmalarında kullanılmak üzere optimum hücre sayısı 12,5x104 olarak tespit edilmistir. 5RP7 hücrelerinin fibronektin’e bağlanmalarının konsantrasyona bağlı olarak değisim gösterdiği ve hücrelerin 30 ?g/ml fibronektin’e maksimal oranda bağlandığı gösterilmistir. Buna karsın, 30 ?g/ml fibronektin’e bağlanan hücrelerin canlılığını sürdürerek apoptoza gitmediği, 10 ?g/ml fibronektin’e bağlanan 5RP7 hücrelerinin ise apoptoza giderek apoptotik DNA belirteci görüntüsüne paralel görüntü verdiği gösterilmistir. Kaspaz-3 ve kaspaz-9’un fibronektin’e bağlı 5RP7 hücre ap ptozu üzerindeki etkileri bu enzimlere spesifik inhibitörlerin eklenmesiyle arastırılmıstır. Kaspaz-3 ve kaspaz- 9 inhibisyonunun fibronektin’e bağlı 5RP7 hücre DNA parçalanma oranını azalttığı belirlenmistir. Sonuç olarak 5RP7 hücrelerinin fibronektin’e bağlı apoptoz mekanizmasının, mitokondrial yolaktan ya da endoplazmik retukuluma bağlı [Ca]+2 artısı sonucunda kaspaz-12 ve daha sonra kaspaz-9 ‘un aktivasyonuna bağlı olduğu düsünülmektedir.